Des algues photosynthétisent en régime stable, alimentées en dioxyde de carbone marqué au carbone 14. On coupe alors une seule condition, le dioxyde de carbone ou la lumière, et on suit la quantité de deux composés. L'un s'accumule, l'autre disparaît. Ce sont ces deux cinétiques qui donnent l'ordre des réactions du cycle et les besoins de chacune.
Sur quelle molécule le dioxyde de carbone est-il fixé, et que faut-il pour transformer le composé qui en résulte ?
Des algues unicellulaires sont éclairées en présence de dioxyde de carbone marqué au carbone 14. Après quelques secondes, les cellules sont tuées et leurs composés séparés par chromatographie. Un film photographique posé sur le chromatogramme révèle les composés radioactifs. Plus l'exposition au carbone 14 est brève, moins il y a de composés marqués.
Pour une exposition de quelques dixièmes de seconde, un seul composé porte l'essentiel du carbone 14 : l'acide phosphoglycérique, ou APG. C'est un acide organique à trois atomes de carbone. Il est donc le premier composé formé après l'entrée du dioxyde de carbone dans la matière organique.
Ce résultat laisse la question de l'origine de l'APG entière. Une molécule reçoit le dioxyde de carbone : elle reste à identifier. Parmi les composés marqués figure un sucre à cinq atomes de carbone portant deux groupements phosphate, le ribulose bisphosphate, ou RuBP. Sa place dans la suite des réactions n'est pas établie pour autant.
La méthode qui a désigné l'APG ne suffit plus ici. Elle classe les composés selon l'ordre où le marquage les atteint. Or les sucres phosphatés du cycle se marquent presque en même temps, et le classement obtenu varie d'une expérience à l'autre.
« Les tentatives d'établir cette relation par les courbes ordinaires d'apparition [du sucre à cinq carbones et du sucre à sept carbones] ont abouti à des conclusions sur l'ordre d'apparition du pentose, de l'hexose et de l'heptose qui variaient d'un jour à l'autre, d'une expérience à l'autre, d'une personne à l'autre. »
M. Calvin, conférence Nobel, décembre 1961, traduit de l'anglais.
L'équipe de Berkeley change alors de principe de mesure. Les algues photosynthétisent longtemps en présence de carbone 14, jusqu'à ce que la radioactivité de chaque composé cesse d'augmenter. Le marquage est alors saturé : tout le carbone qui traverse le composé est du carbone 14. La radioactivité mesurée devient proportionnelle à la quantité de ce composé présente dans la cellule. Suivre la radioactivité revient à suivre le stock.
Il suffit alors de supprimer un réactif et de regarder quel stock monte et quel stock descend. Deux réactifs sont supprimables sans rien changer d'autre : le dioxyde de carbone, et la lumière. Deux expériences en découlent. Elles ont été conduites dans l'équipe de Melvin Calvin, à Berkeley : le passage à l'obscurité par Peter Massini puis par James Bassham, la suppression du dioxyde de carbone par Alexander Wilson.
Quelle molécule reçoit le dioxyde de carbone ?
Les algues sont éclairées pendant toute la durée de l'expérience. Elles reçoivent du dioxyde de carbone marqué pendant les cinq cents premières secondes. L'alimentation en dioxyde de carbone est ensuite interrompue. La lumière, elle, ne change pas.
Le graphique donne la radioactivité de l'APG et du RuBP au cours du temps. Le schéma de droite montre les réactions qui produisent et qui consomment ces deux composés, et le stock de chacun. Suivre l'un et l'autre en même temps donne la réponse.
Sa synthèse s'arrête à l'instant où le dioxyde de carbone disparaît, alors que son utilisation continue. L'APG est donc formé immédiatement après la fixation du dioxyde de carbone, sans intermédiaire stable.
Il n'est plus consommé, alors que sa synthèse continue quelque temps : c'est donc lui qui recevait le dioxyde de carbone. Sa synthèse se tarit ensuite, faute d'APG. Le RuBP est régénéré à partir de l'APG.
Les deux stocks finissent par s'épuiser. Aucun carbone marqué n'entre plus dans la cellule, et le carbone déjà présent dans le cycle rejoint les produits finaux de la photosynthèse.
Quelles réactions du cycle exigent les produits de la phase photochimique ?
Les algues reçoivent du dioxyde de carbone marqué pendant toute la durée de l'expérience. Elles sont éclairées pendant les cinq cents premières secondes, placées à l'obscurité pendant cinq cents secondes, puis éclairées de nouveau.
La lumière n'agit pas directement sur les réactions du cycle. Elle agit par les produits de la phase photochimique : l'ATP et le NADPH+H+. Éteindre la lumière revient donc à supprimer ces deux composés.
Il continue d'être produit, puisque le dioxyde de carbone et le RuBP sont là. Il n'est plus transformé. La réaction qui consomme l'APG exige donc l'ATP et le NADPH+H+, produits par la phase photochimique.
Il continue d'être consommé par la fixation du dioxyde de carbone, réaction qui n'exige pas la lumière. Il n'est plus régénéré. Sa régénération exige donc elle aussi les produits de la phase photochimique.
Le retour à la lumière rétablit l'état de départ. Les deux stocks retrouvent leur valeur initiale. Les variations observées sont donc bien des effets de la seule condition modifiée, et non une dégradation des cellules.
Comment les deux expériences se combinent-elles en un seul enchaînement de réactions ?
| Condition supprimée | APG | RuBP | Conséquence sur l'ordre des réactions |
|---|---|---|---|
| Dioxyde de carbone, à la lumière | Diminue sans délai | Augmente pendant une cinquantaine de secondes, puis diminue | L'APG est formé aussitôt après la fixation du dioxyde de carbone. Le RuBP est la molécule qui reçoit ce dioxyde de carbone. Sa régénération dépend de l'APG, donc elle vient après lui dans l'enchaînement. |
| Lumière, en présence de dioxyde de carbone | Augmente fortement, puis se stabilise | S'effondre jusqu'à une valeur presque nulle | La fixation du dioxyde de carbone n'exige pas la lumière. La transformation de l'APG l'exige. La régénération du RuBP l'exige aussi. |
Un seul enchaînement rend compte de ces quatre observations. Il est fermé sur lui-même : la molécule qui reçoit le dioxyde de carbone est reformée à partir du composé qu'elle produit. C'est un cycle.
Pour six molécules de dioxyde de carbone fixées sur six RuBP, douze molécules d'APG sont formées. Leur réduction consomme douze ATP et douze NADPH+H+, et donne douze trioses phosphate. Dix d'entre eux régénèrent les six RuBP, avec six ATP supplémentaires. Les deux trioses restants sortent du cycle et donnent une molécule de glucose.
6 CO2 + 6 RuBP + 18 ATP + 12 NADPH+H+ → C6H12O6 + 6 RuBP + 18 ADP + 18 Pi + 12 NADP Le RuBP figure des deux côtés : il est consommé puis reformé, ce qui est le propre d'un cycle. Écriture simplifiée : les molécules d'eau échangées au cours des réactions ne sont pas portées.
L'enzyme qui fixe le dioxyde de carbone sur le RuBP est la ribulose bisphosphate carboxylase, appelée Rubisco. Elle porte le nom de carboxydismutase dans les publications de l'équipe de Calvin.