L'expérience de Calvin

Une suspension d'algues vertes en photosynthèse s'écoule à débit constant dans une tubulure transparente éclairée. À la sortie de cette tubulure, du méthanol bouillant tue les cellules et arrête toute réaction. Du dioxyde de carbone marqué au carbone 14 est injecté en un point du parcours. La longueur de tubulure qui sépare ce point du méthanol impose la durée du contact entre les algues et le traceur. Choisissez ce point à la souris, recueillez l'extrait, chromatographiez-le, puis comparez les autoradiographies obtenues.

Quel est le premier composé organique formé à partir du dioxyde de carbone, et dans quel ordre le carbone gagne-t-il ensuite les autres molécules ?

Principe du montage

L'écoulement continu, ou comment imposer une durée de contact

Les premières réactions de la fixation du dioxyde de carbone se comptent en secondes. Dans une cuve immobile, l'expérimentateur prélève l'échantillon puis le tue. La durée d'exposition dépend donc de son geste. Elle se règle mal en dessous de quelques secondes, et elle se reproduit difficilement d'un essai à l'autre. Le montage à écoulement continu lève cette difficulté. Il convertit la durée d'exposition en une longueur de tubulure. Cette longueur ne dépend plus du geste de l'expérimentateur.

Une cuve éclairée contient la suspension d'algues vertes unicellulaires en photosynthèse, du genre Scenedesmus ou Chlorella. Sa forme lui vaut le nom de lollipop. Une pompe fait s'écouler la suspension à débit constant dans une tubulure transparente enroulée en serpentin. Cette tubulure est éclairée elle aussi. À la sortie, la suspension tombe dans du méthanol bouillant. Les cellules sont tuées, les enzymes sont dénaturées et toute réaction cesse. Le méthanol fait en même temps passer en solution les molécules organiques solubles des algues. Cette solution est l'extrait que l'on analyse ensuite.

Le dioxyde de carbone marqué est dissous dans l'eau. Il est injecté à la seringue en un point de la tubulure. Les algues rencontrent le traceur en franchissant ce point. Elles restent ensuite à son contact jusqu'à leur chute dans le méthanol. Le débit est constant et connu. La longueur de tubulure comprise entre le point d'injection et le méthanol donne donc la durée du contact. L'injection est déplacée vers l'amont : cette durée s'allonge. L'injection est déplacée vers l'aval : cette durée se raccourcit. Une même culture fournit ainsi des échantillons qui correspondent à des durées de contact différentes, dans des conditions par ailleurs identiques.

Principe de l'analyse

Le marquage au carbone 14, la chromatographie bidimensionnelle et l'autoradiographie

Le carbone 14 est un isotope radioactif du carbone. Une molécule de dioxyde de carbone qui en contient participe aux mêmes réactions qu'une molécule de dioxyde de carbone ordinaire. Un effet isotopique modifie légèrement la vitesse des réactions. Il ne change pas le trajet du carbone. Les algues fixent donc cette molécule de la même façon. Toutes les molécules organiques construites à partir d'elle deviennent radioactives. Marquer le dioxyde de carbone, c'est donc marquer le carbone lui-même, et le suivre dans toutes les molécules où il entre.

L'extrait obtenu dans le méthanol contient un mélange de molécules. Il est déposé sur une feuille de papier. Cette feuille est développée successivement dans deux solvants différents, selon deux directions perpendiculaires. C'est la chromatographie bidimensionnelle. Chaque molécule migre plus ou moins loin selon la façon dont elle se répartit entre le solvant qui progresse et l'eau retenue par le papier. Le second solvant sépare ensuite, dans la direction perpendiculaire, les molécules que le premier n'avait pas séparées. Chaque molécule occupe ainsi une position propre sur la feuille. Cette position est toujours la même pour un même papier et pour les mêmes solvants.

La feuille est ensuite mise au contact d'un film photographique. Là où se trouvent des molécules radioactives, le film noircit : c'est l'autoradiographie. Elle ne révèle donc que les molécules qui ont incorporé du carbone 14. L'intensité de chaque tache mesure la radioactivité de la molécule qui l'occupe. Les taches ne portent pas de nom. Chacune est identifiée par comparaison de sa position avec celle de substances témoin, déposées sur d'autres chromatographies.

Écoulement du temps Temps de fonctionnement 0 s
Point d'injection du dioxyde de carbone marqué

Injection en attente.

Cliquez sur la tubulure, puis faites glisser sans relâcher pour déplacer le point d'injection le long du serpentin.

Gestes de laboratoire

L'extrait n'est exploitable que si les algues recueillies ont toutes franchi le point d'injection.

Durées de contact à reproduire

Ces boutons placent l'injection à la distance du méthanol qui donne cette durée de contact. Ils conduisent ensuite seuls la manipulation, chromatographie comprise.

Algue n'ayant pas rencontré le dioxyde de carbone marqué Algue ayant incorporé du carbone 14 Portion de suspension contenant le dioxyde de carbone marqué Méthanol bouillant

Les points rouges portés par les algues figurent le carbone 14 incorporé dans leurs molécules organiques. La figure ne dit pas quelles molécules sont marquées. C'est la chromatographie qui les identifie.

Durée du contact avec le dioxyde de carbone marqué
-
Tubulure entre l'injection et le méthanol
-
Progression de la portion marquée
0 %
Algues recueillies dans le méthanol
0

Résultats : les autoradiographies des chromatographies

Chaque autoradiographie est accompagnée d'une fiche. Cette fiche donne la durée de contact pour laquelle la plaque a été obtenue, et la répartition du carbone 14 entre les taches.

Aucune autoradiographie
Aucune autoradiographie pour le moment. Choisissez un point d'injection, laissez la portion marquée atteindre le méthanol, puis chromatographiez l'extrait.