Des chloroplastes isolés d'une feuille broyée, mis en suspension dans un milieu dépourvu de carbone minéral, dégagent du dioxygène dès qu'on les éclaire en présence d'un oxydant étranger, alors qu'aucune matière organique ne se forme. Isoler les chloroplastes, supprimer le dioxyde de carbone, offrir aux électrons de l'eau un accepteur de remplacement, compter les électrons transférés : la démarche qui établit que l'oxydation de l'eau et la réduction du carbone sont deux réactions séparables, reliées par un transporteur d'électrons.
Le dégagement de dioxygène et la réduction du dioxyde de carbone sont-ils les deux faces d'une même réaction, ou deux réactions séparables ?
Le bilan de la photosynthèse est établi depuis le XIXe siècle : à la lumière, les parties chlorophylliennes d'une plante consomment du dioxyde de carbone et de l'eau, produisent de la matière organique et libèrent du dioxygène.
6 CO2 + 12 H2O → C6H12O6 + 6 O2 + 6 H2O
Ce bilan compte les réactifs et les produits d'un processus pris dans son ensemble. Il ne dit pas si ce processus est une transformation unique, ni s'il se décompose en réactions que l'on pourrait faire fonctionner séparément. Deux séries de mesures antérieures suggèrent pourtant une décomposition. En 1905, Frederick Blackman constate que sous forte lumière le rendement de la photosynthèse dépend de la température, ce qui trahit une étape sensible à la température, donc non photochimique. En 1932, Robert Emerson et William Arnold éclairent des chlorelles par éclairs très brefs séparés d'intervalles d'obscurité : le rendement rapporté à un éclair augmente lorsque l'intervalle sombre s'allonge, jusqu'à un palier. Une réaction se poursuit donc dans le noir, après l'éclair, et limite le processus tant qu'elle n'est pas achevée.
Une seconde indication vient de la comparaison entre organismes. Les bactéries sulfureuses photosynthétiques réduisent elles aussi le dioxyde de carbone à la lumière, mais elles ne libèrent pas de dioxygène : elles consomment du sulfure d'hydrogène et déposent du soufre. En 1931, Cornelis van Niel en tire une écriture commune à tous ces organismes, dans laquelle une substance H2A fournit les atomes d'hydrogène et les électrons nécessaires à la réduction du carbone, et se trouve oxydée en A :
CO2 + 2 H2A → CH2O + H2O + 2 A H2A = H2S chez les bactéries sulfureuses, H2O chez les plantes vertes
Cette écriture fait de la photosynthèse une réaction d'oxydoréduction : un donneur d'électrons est oxydé, le carbone minéral est réduit. Elle reste, en 1931, une généralisation déduite de la comparaison entre espèces, non un résultat expérimental obtenu chez les plantes vertes. Deux modèles restent compatibles avec tout ce qui est alors connu.
Les électrons passent directement de l'eau au dioxyde de carbone au cours d'une même transformation. Le dioxygène ne peut être libéré que si, dans le même temps, du carbone est réduit : supprimer le dioxyde de carbone supprime tout.
L'eau est oxydée d'un côté, le carbone réduit de l'autre, et un transporteur d'électrons relie les deux : il prend les électrons arrachés à l'eau, puis les cède au carbone. Chacune des deux réactions peut alors fonctionner seule, pourvu que le transporteur trouve un partenaire.
Le test le plus direct semble être de retirer le dioxyde de carbone et de regarder si le dioxygène continue de se dégager. Il ne tranche rien. Dans le modèle A, la réaction s'arrête faute de réactif. Dans le modèle B, elle s'arrête également, mais pour une autre raison : le transporteur, une fois chargé des électrons de l'eau, n'a plus à qui les céder ; il reste sous forme réduite et l'oxydation de l'eau s'interrompt en amont. Les deux modèles prévoient ici le même résultat, l'absence de dégagement.
Conséquence vérifiable. Il faut donc à la fois supprimer le dioxyde de carbone et offrir aux électrons un autre partenaire, un oxydant étranger à la plante, incapable de former de la matière organique. Si le modèle A est exact, cet oxydant ne peut rien changer : sans réduction du carbone, pas de dioxygène. Si le modèle B est exact, l'oxydant prend la place du transporteur naturel, l'oxydation de l'eau reprend, et le dioxygène se dégage alors qu'aucune matière organique ne se forme. Les deux prédictions sont incompatibles.
Comment obtenir une préparation qui puisse dégager du dioxygène sans réduire de dioxyde de carbone, et comment mesurer ce dégagement ?
Des feuilles fraîches sont découpées puis broyées au froid dans une solution tampon contenant du saccharose, dont la concentration maintient les organites dans un milieu de pression osmotique voisine de celle du cytoplasme. Le broyat est filtré : les fragments de tissus et les débris cellulaires sont retenus, un liquide vert les traverse. Ce filtrat contient des chloroplastes libres, que l'observation au microscope permet de vérifier. Il est conservé au froid et à l'obscurité jusqu'à la mesure.
La préparation obtenue n'est pas un chloroplaste intact en suspension. Le broyage rompt l'enveloppe d'une grande partie des organites, et le contenu soluble du stroma se dilue dans le milieu. Les membranes internes, porteuses des pigments, restent en revanche fonctionnelles : c'est cette partie de l'organite que la préparation conserve, et c'est elle dont on va mesurer l'activité. Une suspension ainsi obtenue ne fixe pas le carbone minéral.
Le milieu de réaction ne contient aucune source de carbone minéral : ni hydrogénocarbonate, ni dioxyde de carbone dissous en quantité notable. On y ajoute un oxydant qui n'existe pas dans la plante, l'oxalate ferrique, sel dans lequel le fer est à l'état d'ion ferrique Fe3+. Le couple mis en jeu est Fe3+/Fe2+ : l'ion ferrique est l'oxydant, capable de capter un électron pour donner l'ion ferreux Fe2+.
Fe3+ + e− → Fe2+
Cet oxydant ne peut en aucun cas être réduit en matière organique : il ne contient pas de carbone. S'il capte des électrons, ceux-ci ne peuvent venir que d'une autre espèce du milieu, et le seul donneur disponible en abondance est l'eau.
Le dioxygène produit est en quantité trop faible pour être recueilli sous forme de bulles. Hill utilise l'hémoglobine comme révélateur : cette protéine fixe le dioxygène de façon réversible, et son spectre d'absorption change lorsqu'elle passe de la forme libre à l'oxyhémoglobine. L'ampleur de ce changement, mesurée au spectroscope, donne la quantité de dioxygène apparue dans le milieu. L'hémoglobine n'intervient pas dans la réaction elle-même : elle sert à la lire.
Aujourd'hui, la même réaction se suit en continu au laboratoire, avec une sonde à dioxygène plongée dans un réacteur clos et agité, éclairé ou occulté à volonté, l'oxydant étant injecté à la seringue en cours d'enregistrement. Une seconde méthode remplace l'ion ferrique par un colorant, le 2,6-dichlorophénolindophénol : bleu sous sa forme oxydée, il devient incolore une fois réduit, et la mesure de l'absorbance du milieu suit alors le nombre d'électrons transférés, la concentration de la forme oxydée restante s'obtenant par la loi de Beer-Lambert.
Dans quelles conditions la suspension de chloroplastes dégage-t-elle du dioxygène, et que devient l'oxydant ajouté ?
La suspension est placée dans le réacteur clos, à l'obscurité, et l'enregistrement commence. On éclaire, on injecte l'oxydant, puis on occulte de nouveau : chaque changement de condition se lit immédiatement sur la courbe.
| Contenu du réacteur | Éclairement | Oxydant ajouté | Dioxygène dégagé | État de l'oxydant à la fin | Matière organique formée |
|---|---|---|---|---|---|
| Suspension de chloroplastes | obscurité | non | nul | aucun oxydant dans le réacteur | aucune |
| Suspension de chloroplastes | lumière | non | faible, et s'épuise en quelques instants | aucun oxydant dans le réacteur | aucune |
| Suspension de chloroplastes | obscurité | oui | nul | inchangé, Fe3+ | aucune |
| Suspension de chloroplastes | lumière | oui | abondant et durable | réduit en Fe2+ | aucune |
| Milieu filtré, sans chloroplastes | lumière | oui | nul | inchangé, Fe3+ | aucune |
Trois conditions sont donc nécessaires ensemble : les chloroplastes, la lumière et l'oxydant. Retirer l'un des trois annule le dégagement. La dernière ligne écarte l'hypothèse d'une réaction purement chimique entre l'oxydant et le milieu sous l'effet de la lumière : sans chloroplastes, rien ne se produit. Aucune de ces conditions ne produit de matière organique, et aucune ne consomme de carbone minéral, puisqu'il n'y en a pas.
Le dégagement faible observé sous lumière en l'absence d'oxydant ajouté mérite attention. Il ne dure pas : il s'arrête de lui-même après une durée brève, alors que l'éclairement se poursuit. Tout se passe comme si la préparation contenait, en petite quantité, une substance capable de jouer le même rôle que l'oxydant ajouté, et qui sature une fois réduite. C'est cette substance que l'oxydant vient relayer.
La mesure ne porte pas seulement sur la présence d'un dégagement, elle porte sur des quantités. La quantité de dioxygène dégagé et la quantité d'ions ferriques réduits sont dans un rapport constant : quatre ions ferriques réduits pour une molécule de dioxygène libérée. Or l'oxydation de deux molécules d'eau en une molécule de dioxygène libère exactement quatre électrons.
2 H2O → O2 + 4 H+ + 4 e− quatre électrons cédés, quatre ions ferriques réduits
Le compte des électrons est donc respecté sans qu'il soit besoin d'invoquer une autre source ou un autre puits : les électrons captés par l'oxydant sont ceux que l'oxydation de l'eau libère. Cette égalité quantitative est ce qui interdit de voir dans le dégagement observé un phénomène accessoire.
Que montre un dégagement de dioxygène obtenu sans la moindre réduction de carbone ?
Le milieu ne contient pas de carbone minéral, et l'oxydant ajouté n'en contient pas davantage : la réduction du carbone est donc impossible dans le réacteur. Le dioxygène s'y dégage malgré tout, à la lumière, en quantité mesurable. Le modèle d'une réaction unique, dans laquelle la libération de dioxygène serait indissociable de la réduction du dioxyde de carbone, est réfuté par cette seule observation.
Le compte des électrons dit ce qui s'est passé à la place. Quatre ions ferriques passent à l'état ferreux pour chaque molécule de dioxygène libérée : ils ont capté quatre électrons. Ces électrons viennent de l'espèce oxydée en même temps, et la seule qui puisse à la fois céder des électrons et fournir les atomes d'oxygène du dioxygène est l'eau. En additionnant les deux demi-équations :
2 H2O → O2 + 4 H+ + 4 e−
4 Fe3+ + 4 e− → 4 Fe2+
2 H2O + 4 Fe3+ → O2 + 4 H+ + 4 Fe2+ oxydation de l'eau couplée à la réduction d'un oxydant qui n'est pas le dioxyde de carbone
La lumière est nécessaire à ce transfert, et l'expérience le montre de la façon la plus simple : à l'obscurité, l'oxydant et les chloroplastes cohabitent sans réagir. Le transfert se fait des électrons de l'eau, faiblement réducteurs, vers un oxydant : il ne peut avoir lieu de lui-même, et c'est l'énergie lumineuse absorbée par les pigments qui le rend possible.
Le dégagement bref observé sous lumière avant tout ajout d'oxydant prend ici son sens : la préparation contient déjà, en petite quantité, une substance capable de recevoir les électrons de l'eau. Une fois cette substance réduite, faute de partenaire pour la réoxyder, le transfert s'arrête. L'oxydant ajouté prend le relais et le transfert reprend, aussi longtemps qu'il en reste sous forme oxydée. Hill énonce cette conclusion en 1939 :
« Il doit donc exister une substance primaire qui est réduite, tout en donnant en même temps du dioxygène. »
« [...] un mécanisme dont l'activité peut être mesurée en dehors de la cellule vivante et qui, sous éclairement, dégage simultanément du dioxygène et réduit une substance inconnue qui n'est pas le dioxyde de carbone. »
R. Hill, Proceedings of the Royal Society B, 127, 1939, p. 192-210, cité et traduit d'après D. A. Walker, Photosynthesis Research, 73, 2002, p. 51-54.
L'oxydant ajouté n'est donc pas le partenaire naturel des électrons de l'eau : il est le réactif qui rend visible une propriété du chloroplaste. Toute substance capable de capter des électrons à ce niveau produit le même effet, et c'est ce que la suite a vérifié : l'oxalate ferrique des premiers essais a été remplacé par le ferricyanure de potassium, puis par des colorants comme le 2,6-dichlorophénolindophénol, avec le même résultat. On désigne depuis sous le nom de réaction de Hill le transfert d'électrons de l'eau vers un accepteur étranger, sous éclairement, par des chloroplastes isolés.
Conclusion. L'oxydation de l'eau, avec libération de dioxygène, et la réduction du carbone minéral sont deux réactions séparables. La première se déroule dans les membranes internes du chloroplaste, exige la lumière, et cède ses électrons à un accepteur ; la seconde n'est pas nécessaire à la première. Le dioxyde de carbone n'est pas l'accepteur direct des électrons arrachés à l'eau : un transporteur s'intercale entre les deux, et un oxydant étranger peut se substituer à lui.
Cette conclusion fonde la distinction, encore employée aujourd'hui, entre une phase photochimique, qui se déroule dans la membrane des thylakoïdes et convertit l'énergie lumineuse en énergie chimique, et une phase non photochimique, qui se déroule dans le stroma et réduit le carbone minéral. Les deux sont reliées par les produits de la première, dont l'accepteur réduit. L'oxydation de l'eau qui ouvre cette chaîne, parce qu'elle exige la lumière, porte le nom de photolyse de l'eau :
2 H2O → O2 + 4 H+ + 4 e−
L'expérience de Hill ne dit pas où vont les protons et les électrons dans la plante, elle établit qu'ils vont ailleurs que directement sur le dioxyde de carbone.
L'expérience ne dit pas quelle est la substance qui reçoit les électrons dans la plante intacte. Elle montre qu'un accepteur existe, et qu'un oxydant étranger peut prendre sa place ; l'identité de l'accepteur naturel est restée inconnue une douzaine d'années. En 1951, trois équipes indépendantes établissent que des chloroplastes éclairés réduisent le nicotinamide adénine dinucléotide phosphate, le NADP, alors désigné sous le nom de nucléotide triphosphopyridinique, et que sa réduction s'accompagne d'un dégagement de dioxygène : l'accepteur naturel est identifié, à la place qu'occupait l'ion ferrique dans le tube de Hill.
Elle ne dit rien non plus du mécanisme par lequel l'eau est oxydée, ni du rôle exact de la lumière dans cette oxydation, ni du nombre de réactions photochimiques mises en jeu. Ces questions relèvent d'expériences d'un autre type, et l'une des réponses est venue de Hill lui-même : avec Fay Bendall, il propose en 1960 le schéma en Z du transport des électrons, qui fait intervenir deux réactions photochimiques en série.
Elle ne prouve pas enfin que le dioxygène de la photosynthèse provient de l'eau chez la plante intacte. Dans le réacteur de Hill, l'eau est bien la seule origine possible des atomes d'oxygène, puisqu'il n'y a rien d'autre ; mais rien n'assure, à ce stade, qu'il en aille de même dans une cellule où le dioxyde de carbone est présent. C'est le marquage isotopique de l'eau et du dioxyde de carbone par l'oxygène 18, conduit par Ruben, Randall, Kamen et Hyde en 1941, qui a répondu à cette question.