Du constat au problème, des trois modèles hypothétiques à leurs conséquences vérifiables, du protocole de 1958 à la confrontation des résultats attendus et des résultats observés : la démarche qui établit que la réplication de l'ADN est semi-conservative.
La mesure de la quantité d'ADN par cellule au cours d'un cycle cellulaire établit un premier fait : cette quantité double au cours de la phase S, se maintient à sa valeur double pendant la phase G2 et la mitose, puis chaque cellule fille entre dans son propre cycle avec la quantité initiale. Chaque molécule d'ADN est donc copiée une fois, et une seule, par cycle.
Un second fait s'y ajoute : les deux cellules issues d'une mitose possèdent le même caryotype et la même information génétique que la cellule dont elles proviennent. La copie n'est pas approximative, elle est conforme : la séquence des nucléotides est conservée.
Un troisième fait vient de la structure de la molécule elle-même. L'ADN est formé de deux brins antiparallèles, appariés selon une règle stricte : l'adénine d'un brin fait toujours face à la thymine de l'autre, la guanine à la cytosine. Il en résulte que la séquence d'un brin détermine entièrement celle de l'autre : chaque brin porte l'information nécessaire à la reconstitution de son complémentaire.
« Il ne nous a pas échappé que l'appariement spécifique que nous avons postulé suggère immédiatement un mécanisme de copie possible pour le matériel génétique. »
J. D. Watson et F. H. C. Crick, Molecular structure of nucleic acids : a structure for deoxyribose nucleic acid, Nature, 171, 25 avril 1953, p. 737-738. Traduction.
Dans un second article, publié cinq semaines plus tard, les mêmes auteurs précisent le mécanisme qu'ils envisagent : avant la duplication, les liaisons hydrogène se rompent, les deux chaînes se déroulent et se séparent, et chacune sert alors de matrice à la formation d'une nouvelle chaîne complémentaire. Ce mécanisme reste, en 1953, une proposition déduite de la structure : rien ne l'établit expérimentalement.
Aucun de ces trois faits ne renseigne sur le devenir de la matière qui constitue la molécule initiale. Le doublement de la quantité d'ADN indique qu'une seconde molécule est formée ; la conformité de la copie indique que la séquence est respectée ; la complémentarité indique qu'un brin peut servir de matrice. Mais rien n'établit que les deux brins de départ se séparent effectivement, ni qu'ils se retrouvent intacts dans les molécules filles : ils pourraient rester appariés l'un à l'autre, ou au contraire être fragmentés et répartis entre les deux copies. Les trois éventualités rendent également compte du doublement de la quantité d'ADN et de la conformité de la séquence.
Au cours de la réplication, que devient la matière de la molécule d'ADN initiale, et comment sa répartition entre les deux molécules filles permet-elle la conservation de l'information génétique ?
Selon chacun des trois mécanismes envisageables, que devient la matière de la molécule initiale au cours d'une réplication ?
Une hypothèse est une proposition avancée en réponse au problème posé et tenue pour vraie à titre provisoire, le temps de la mettre à l'épreuve. « Les deux brins de la molécule initiale se séparent au cours de la réplication » est une hypothèse : elle énonce quelque chose sur le réel, elle peut être vraie ou fausse, et rien dans les faits connus ne permet encore de trancher.
Prise telle quelle, cette proposition ne dit cependant pas ce que l'on devrait observer si elle était vraie. Elle ne se confronte donc à aucune expérience. Pour qu'elle devienne testable, il faut lui donner la forme d'un modèle hypothétique : une représentation construite du mécanisme supposé, qui précise les objets en jeu et leur nombre, leur état avant et après la réplication, et la règle qui fait passer d'un état à l'autre.
La différence est celle-ci : l'hypothèse énonce, le modèle fonctionne. Un modèle se fait tourner, une réplication après l'autre, sur une population de molécules, et l'on en déduit par construction ou par calcul ce que chaque génération devrait contenir. Ces déductions sont les conséquences vérifiables du modèle : des résultats attendus, chiffrés, que l'expérience pourra confirmer ou contredire. Une hypothèse sans modèle ne prédit rien de mesurable.
Les trois modèles reposent sur les mêmes objets, les deux brins de la molécule initiale, et sur la même règle de complémentarité des bases. Ils ne diffèrent que sur un point : le devenir de la matière parentale.
« Nous avons cherché à savoir si l'ADN se réplique de façon semi-conservative, de façon dispersive ou de façon conservative. Autrement dit, à chaque division, est-ce que les deux brins se séparent, restent sous la forme d'un simple brin pendant un certain temps puis se retrouvent associés chacun à un brin nouvellement synthétisé ? Ou bien est-ce qu'ils se disloquent et sont ensuite dispersés ? Ou bien est-ce que les deux brins restent indéfiniment accolés et permettent la synthèse, à côté d'eux, d'une molécule dont les deux brins sont nouvellement synthétisés ? »
M. Meselson et F. W. Stahl, The replication of DNA in Escherichia coli, Proceedings of the National Academy of Sciences, 44(7), 1958, p. 671-682. Traduction.
Les deux brins de la molécule initiale restent appariés l'un à l'autre. Ils servent de matrice sans se dissocier durablement, et une molécule dont les deux brins sont néosynthétisés se forme à côté d'eux. La molécule initiale se retrouve intacte à l'issue de la réplication.
Les deux brins de la molécule initiale se séparent. Chacun sert de matrice à la synthèse d'un brin complémentaire. Chaque molécule fille associe donc un brin parental, conservé intact sur toute sa longueur, et un brin néosynthétisé.
La molécule initiale est fragmentée. Ses segments sont répartis entre les deux molécules filles, où ils alternent avec des segments néosynthétisés. Chaque brin de chaque molécule fille est alors une mosaïque de matière parentale et de matière nouvelle.
Comment distinguer, dans un extrait d'ADN, les brins formés avant le début de l'expérience de ceux formés après ?
L'azote entre dans la composition des bases azotées des nucléotides. Il n'est présent ni dans le désoxyribose, ni dans le groupement phosphate : toute base azotée formée par une bactérie est donc construite avec l'azote que lui fournit son milieu de culture.
L'azote existe sous deux formes stables, l'azote 14 et l'azote 15, dont les noyaux ne diffèrent que par un neutron. Leurs propriétés chimiques sont les mêmes, leur comportement dans le métabolisme est le même, et ni l'une ni l'autre n'est radioactive : elles ne se distinguent que par leur masse. Une bactérie cultivée sur un milieu où l'azote n'est fourni que sous forme de chlorure d'ammonium à azote 15 incorpore cet isotope dans tous les nucléotides qu'elle synthétise.
Meselson et Stahl cultivent Escherichia coli à 36 °C sur un milieu minimum glucosé dont l'unique source d'azote est le chlorure d'ammonium à azote 15. Après plusieurs générations, tout l'ADN de la population est uniformément lourd. À l'instant pris pour origine des temps, ils ajoutent au milieu un large excès de chlorure d'ammonium à azote 14. La culture poursuit sa croissance : à partir de cet instant, tout nucléotide nouvellement formé porte de l'azote 14, tandis que les nucléotides déjà en place gardent leur azote 15. La date de synthèse de chaque brin est ainsi inscrite dans sa masse. Des échantillons de culture sont prélevés à intervalles réguliers, les bactéries lysées et leur ADN extrait.
Une molécule d'ADN à azote 15 et son homologue à azote 14 ont la même séquence, la même longueur, la même charge, la même forme et les mêmes propriétés chimiques. Elles ne diffèrent que par la masse de leurs atomes d'azote. Or l'azote ne représente qu'environ 17 % de la masse de l'ADN, et un atome d'azote 15 n'est plus lourd qu'environ un quatorzième d'un atome d'azote 14 : le remplacement complet de l'azote 14 par l'azote 15 n'augmente la masse de la molécule que d'environ 1 %, très exactement de 1,2 %. Aucune des techniques de séparation usuelles ne discrimine deux molécules identiques à 1 % de masse près.
Une seconde difficulté s'ajoute à la première : l'extraction fragmente l'ADN bactérien en morceaux de longueurs très variables. Un tri fondé sur la masse serait donc doublement inopérant, car les écarts de masse dus à la longueur des fragments sont sans commune mesure avec l'écart de 1 % dû à l'isotope.
La solution consiste à trier les molécules non pas selon leur masse, mais selon leur masse volumique. Cette grandeur ne dépend pas de la taille du fragment considéré : tous les fragments d'un même ADN, longs ou courts, ont la même masse volumique. Dans une solution de chlorure de césium, l'ADN à azote 14 se comporte comme un corps de masse volumique 1,710 g/cm3, l'ADN à azote 15 comme un corps de masse volumique 1,724 g/cm3 : c'est ce que l'on appelle leur densité de flottaison, et l'écart est de 0,014 g/cm3, soit 0,8 %. Il faut donc une méthode capable de résoudre un écart de masse volumique de huit millièmes. C'est celle que Meselson, Stahl et Vinograd mettent au point l'année précédente.
L'ADN extrait est mélangé à une solution concentrée de chlorure de césium, de masse volumique voisine de 1,71 g/cm3, puis soumis pendant 20 heures à 25 °C à un champ centrifuge de 140 000 fois l'intensité de la pesanteur, obtenu à 44 770 tours par minute dans une ultracentrifugeuse analytique.
Le sel dissous, dissocié en ions césium et chlorure, sédimente vers le fond du tube sous l'effet du champ, tandis que la diffusion tend au contraire à le redistribuer uniformément. L'équilibre entre ces deux processus antagonistes établit dans le tube un gradient continu de masse volumique, croissant du haut vers le fond.
Chaque molécule d'ADN se déplace alors dans ce gradient jusqu'au niveau où la masse volumique de la solution égale la sienne : plus haut, elle sédimente ; plus bas, elle est repoussée vers le haut. Elle se rassemble donc en une bande étroite à sa position d'équilibre, et cette position ne dépend que de sa masse volumique, non de sa taille. Deux populations dont les masses volumiques diffèrent de 0,014 g/cm3 forment deux bandes nettement séparées : un mélange d'ADN à azote 14 et d'ADN à azote 15 préparés séparément donne bien deux bandes distinctes, ce qui vérifie le pouvoir de résolution de la méthode.
La lecture se fait sans ouvrir le tube. L'ADN absorbe fortement le rayonnement ultraviolet, avec un maximum au voisinage de 260 nm : le contenu du tube est photographié en lumière ultraviolette pendant la centrifugation, et chaque bande d'ADN apparaît comme une zone sombre sur le cliché. Le cliché est ensuite analysé au microdensitomètre, appareil qui traduit le noircissement en une courbe. Sur ce profil, la position d'un pic donne la masse volumique de la population correspondante, et son aire donne sa proportion dans l'échantillon.
Quelles proportions de molécules légères, hybrides et lourdes chacun des trois modèles conduit-il à attendre après une, deux, puis trois réplications en milieu à azote 14 ?
Tout brin formé avant le passage en milieu à azote 14 contient de l'azote 15 : il est lourd. Tout brin formé après contient de l'azote 14 : il est léger. Dans les schémas, les brins parentaux, lourds, restent bleus, et les brins néosynthétisés, légers, rouges.
La masse volumique d'une molécule dépend de sa teneur globale en azote 15. Trois compositions sont donc à distinguer :
Plus généralement, une molécule dont une fraction f de l'azote est de l'azote 15 se place à la masse volumique 1,710 + 0,014 f. Cette relation permet de placer les molécules mosaïques du modèle dispersif, pour lesquelles f vaut un demi après une réplication, un quart après deux, un huitième après trois.
Chaque modèle est appliqué à une molécule de départ dont les deux brins sont lourds, puis répliqué selon sa propre règle. Les proportions ci-dessous sont des proportions du nombre de molécules, celles-là mêmes que donne l'aire des pics du profil densitométrique.
| Génération | Modèle conservatif | Modèle semi-conservatif | Modèle dispersif |
|---|---|---|---|
| 0, avant le passage en azote 14 | 100 % lourde | 100 % lourde | 100 % lourde |
| 1, après une réplication | 50 % lourde et 50 % légère | 100 % hybride | 100 % à 1,717 g/cm3 |
| 2, après deux réplications | 25 % lourde et 75 % légère | 50 % hybride et 50 % légère | 100 % à 1,7135 g/cm3 |
| 3, après trois réplications | 12,5 % lourde et 87,5 % légère | 25 % hybride et 75 % légère | 100 % à 1,71175 g/cm3 |
Le modèle conservatif se sépare des deux autres dès la première génération : il est le seul à prévoir deux bandes situées aux deux positions extrêmes, et le seul à ne prévoir, à aucune génération, de molécule de masse volumique intermédiaire. Il maintient par ailleurs indéfiniment une bande lourde, puisque la molécule de départ n'est jamais entamée.
Les modèles semi-conservatif et dispersif prévoient en revanche exactement le même résultat à la première génération : une bande unique, à la position intermédiaire. La première génération ne permet donc pas de les départager. C'est la deuxième qui les sépare, et sur deux points : le modèle semi-conservatif prévoit deux bandes, dont l'une occupe encore exactement la position intermédiaire de la génération précédente ; le modèle dispersif prévoit une bande unique, dont la position s'est déplacée vers celle de l'ADN léger.
Lequel des trois modèles rend compte des résultats effectivement observés ?
Il est contredit dès la première génération. Il prévoit la persistance d'une bande lourde et l'apparition d'une bande légère ; on n'observe ni l'une ni l'autre, mais une bande unique de position intermédiaire, que ce modèle ne peut produire à aucune génération, puisqu'il n'associe jamais dans une même molécule un brin lourd et un brin léger.
Il rend compte de la première génération, mais il est contredit à la deuxième. Il prévoit une bande unique dont la position se rapproche de celle de l'ADN léger ; on observe deux bandes séparées, et la bande intermédiaire n'a pas bougé. La matière parentale n'est donc pas fragmentée : elle subsiste en unités qui gardent leur teneur en azote 15.
Ses trois conséquences vérifiables se réalisent : une bande unique intermédiaire à la première génération, deux bandes d'aires égales à la deuxième, une bande intermédiaire qui conserve sa position et dont la proportion est divisée par deux à chaque génération sans jamais s'annuler. Aucun résultat ne le contredit.
Meselson et Stahl soumettent ensuite l'ADN de la première génération à un chauffage, qui rompt les liaisons hydrogène et sépare les deux brins de chaque molécule. Le produit obtenu, centrifugé dans les mêmes conditions, donne deux populations distinctes : l'une à la position attendue pour un brin isolé à azote 15, l'autre à celle d'un brin isolé à azote 14. Chacune des deux sous-unités de la molécule hybride est donc de composition isotopique homogène.
Ce contrôle élimine le modèle dispersif par une seconde voie, indépendante de la première : si la matière parentale avait été fragmentée puis dispersée, chaque brin isolé serait lui-même une mosaïque de segments lourds et légers et se placerait à une position intermédiaire, unique. Il établit en outre que les unités conservées au cours de la réplication sont bien des brins entiers.
C'est ce mécanisme qui rend compte de la reproduction conforme : la séquence de chaque brin parental impose, par complémentarité des bases, celle du brin qui se construit en face de lui. Les deux cellules issues de la mitose reçoivent ainsi deux lots d'information génétique identiques.
L'expérience ne montre à aucun moment les brins eux-mêmes : elle mesure des masses volumiques, dont on déduit des compositions isotopiques. Ce qu'elle établit directement, c'est que l'azote d'une molécule d'ADN se répartit à parts égales entre deux sous-unités qui demeurent intactes au fil des générations, formulation prudente qui est celle des auteurs eux-mêmes. L'identification de ces sous-unités aux deux brins de la double hélice vient de la structure établie par Watson et Crick, et la dénaturation de l'ADN hybride la confirme.
Enfin, la conclusion garde le statut que lui donne la démarche : deux modèles sont réfutés, et le troisième est le seul des trois à rendre compte de l'ensemble des résultats. Il n'en est pas démontré pour autant : il reste le modèle en vigueur tant qu'aucune observation ne le contredit.