Le devenir des ARN marqués à l'uracile radioactif

Le marquage bref, ou pulse, et la chasse, ou chase

Aucune méthode ne permet de suivre une molécule à travers une cellule vivante. La technique du marquage bref suivi d'une chasse, couramment désignée par son nom anglais de pulse-chase, contourne cet obstacle : elle marque d'un seul coup toutes les molécules d'une même famille synthétisées pendant un court intervalle de temps, puis établit où elles se trouvent aux instants qui suivent.

Le premier temps est le marquage bref, ou pulse. Le milieu de culture reçoit pendant quelques minutes un précurseur radioactif, c'est-à-dire une petite molécule que la cellule emploie pour construire les molécules de la famille étudiée. Toutes celles qu'elle synthétise pendant ce temps, et elles seules, deviennent radioactives : elles forment une population de même âge.

Le second temps est la chasse, ou chase. Le précurseur radioactif est retiré du milieu, le plus souvent remplacé par le même précurseur non radioactif en excès, qui dilue ce qu'il en reste dans la cellule. Les molécules synthétisées ensuite ne sont plus marquées et la population marquée n'est plus renouvelée : il ne reste qu'à révéler sa position après des durées de chasse croissantes. Chaque révélation détruit la culture ; les images obtenues sont autant d'instantanés pris sur des cultures différentes, et c'est leur comparaison, non le suivi d'une molécule, qui donne l'ordre dans lequel les compartiments de la cellule sont occupés.

Deux conditions font la valeur du résultat : le précurseur doit être propre à la famille de molécules étudiée, sans quoi le marquage ne renseigne sur rien ; et le marquage doit être bref devant la durée du phénomène observé, sans quoi les molécules marquées ont des âges trop différents pour que les images se distinguent. Sous ces conditions, la technique s'applique à toute famille de molécules dont on connaît un précurseur spécifique : la thymidine pour l'ADN, un acide aminé pour les protéines, l'uracile ou l'uridine pour les ARN.

Le marquage des ARN à l'uracile radioactif

L'uracile est l'une des quatre bases azotées des ARN. L'ADN n'en contient pas : il renferme de la thymine à sa place. De l'uracile rendu radioactif est ajouté au milieu de culture ; les cellules le prélèvent et l'incorporent dans les ARN qu'elles synthétisent. Seules les molécules formées tant que le précurseur radioactif reste disponible sont donc marquées ; celles qui existaient déjà ne le sont pas.

En fin d'expérience, la culture est photographiée à l'aide d'une plaque sensible à la radioactivité : c'est l'autoradiographie. Là où l'uracile radioactif a été incorporé dans des molécules, on observe des grains noirs. Le lavage, qui précède, remplace le milieu et élimine l'uracile radioactif resté libre, c'est-à-dire non incorporé.