Séparation des anticorps plasmatiques par électrophorèse

Objectif : Présenter une technique qui permet de séparer les anticorps des autres protéines du sérum.

Préparation

- Faire tremper 15 minutes les bandes de cellogel dans la solution tampon à pH 9,2.
- Faire sécher les bande de cellogel entre deux feuilles de papier filtre.

- Installer les bandes de cellogel dans la cuve à électrophorèse, face absorbante (mate) sur le dessus.
- Remplir les deux compartiments de la cuve de solution tampon à pH 9,2, jusqu'aux 2/3 de la hauteur de la séparation centrale.

- tremper l'extrémité de l'applicateur dans le sérum, un film de sérum s'installe entre les deux fils. Déposer le sérum avec l'applicateur sur la bande de cellogel à 1,5 cm du côté du pôle négatif. Le dépôt doit se faire bien à plat, perpendiculairement au sens de migration.
- fermer le couvercle et brancher la cuve sur l'alimentation.
- Laisser migrer pendant 60 minutes.
- Arrêter le générateur.

- Sortir les bandes et les tremper 5 minutes dans le colorant, la face absorbante contre le colorant.
- faire tremper dans des solutions d'acide acétique à 5 % jusqu'à obtenir un fond parfaitement blanc.
- sécher sur un papier filtre.

Observation des bandes de coloration

Les protéines les plus petites (albumine) migrent le plus loin, les plus grosses (gamma-globulines) migrent moins loin.

Lecture optique des bandes pour évaluer les concentrations des différentes protéines

Plus la concentration en protéines est forte dans une portion de gel, plus la coloration est forte. On peut donc évaluer les concentrations des différentes catégories de protéines par mesure optique de la densité de coloration sur la bande.
La lecture optique se fera grâce à un système ExAO que l'on passe sur la bande.
A défaut de système de lecture spécifique, on peut utiliser un scanner. La densité de couleur des images sera ensuite lue avec les outils du logiciel Mesurim. C'est l'utilisation de ce logiciel qui est présentée dans la suite.
Si on dispose d'un scanner à plat compatible Twain, la scannérisation peut se faire à l'aide du logiciel Mesurim ce qui évitera d'avoir à créer une échelle pour l'image avant la mesure. C'est l'utilitaire normal de scannérisation, propre au scanner qui est appelé par Mesurim.
Choisir les paramètres de scannérisation sans détrammage ni changement de contraste... qui modifieraient l'image par rapport au document d'origine.
Indiquer la résolution utilisée par le scanner lorsque le logiciel le demande. Cela permet d'établir l'échelle de l'image.

- Sauvegarder l'image dans un fichier .jpg de préférence (les nuances seront mieux conservées qu'avec un fichier .gif).
- Cliquer sur l'icône de mesure, tracer la ligne suivant laquelle la mesure de lumière sera faite, puis choisir le menu Mesure de lumière sur une bande.
- Choisir une largeur d'une dizaine de pixels (essayer aussi moins pour voir la différence), une mesure en absorption concernant tous les canaux puis cliquer sur le bouton Mesurer. La courbe s'affiche sur un graphique qui peut être sauvegardé.

On remarque un décalage vers le haut de la courbe sur la droite du graphique. Cela correspond à la couleur de fond rose de la droite de l'électrophorèse. La durée utilisée était sans doute insuffisante pour une séparation complète.

Comparaison avec les électrophorèses de malades

Le malade dont l'électrophorèse de plasma est présentée est atteint d'un cancer touchant un clone de lymphocytes B. Les cellules de ce clone se multiplient anormalement et produisent un type d'anticorps en grande quantité. Un autre malade, atteint d'une maladie infectieuse comme le tétanos, aurait une électrophorèse de sérum comparable. Le pic des gamma-globulines est ici très accentué.

On peut récupérer les protéines en découpant un morceau d'une bande d'électrophorèse.
Comment , à partir de l'électrophorèse d'un malade atteint de tétanos, peut-on tester l'hypothèse que les gamma-globulines comprennent bien les anticorps ?